无创产前检测技术在胎儿脉络丛囊肿筛查染色体异常的应用

摘要

目的

探讨无创产前检测技术（NIPT）应用于胎儿脉络丛囊肿（CPC）筛查染色体异常的临床价值。

方法

回顾性分析因胎儿CPC或CPC合并其他超声软指标异常孕妇选择NIPT的临床资料，总结NIPT的检出率、阳性预测值等指标。

结果

608例胎儿CPC或CPC合并其他超声软指标异常孕妇中，16例胎儿为高风险，检出率为2.6%（16/608），9例为染色体非整倍体，7例为染色体拷贝数变异（CNV）。15例孕妇选择了浸入性产前诊断，确诊8例，阳性预测值（PPV）为53.3%（8/15）。≥35岁和<35岁的胎儿CPC检出率差异无统计学意义（${\chi }^{\mathrm{2}}$=0.000，P=1.000）。iCPC和cCPC的检出率差异有统计学意义（${\chi }^{\mathrm{2}}$=8.988，P=0.003）。双侧、左侧和右侧胎儿CPC的检出率差异无统计学意义（P>0.05）。

结论

CPC与胎儿染色体异常存在相关性。NIPT可应用于超声提示胎儿CPC孕妇的可选筛查技术，且筛查准确性较高，避免侵入性检查，有助于提高产前诊断的检出率，降低产前诊断压力。

关键词

无创产前检测技术; 脉络丛囊肿; 染色体异常

脉络丛囊肿（choroid plexus cyst, CPC）是指发生在颅内脉络丛内的无回声囊性结构，是胎儿较常见的超声软指标之一^［1］。根据是否合并其他超声异常，CPC分为孤立性脉络丛囊肿（isolated CPC, iCPC）和复杂性脉络丛囊肿（complicated CPC, cCPC）。研究发现，CPC与胎儿染色体异常有一定关系，如18-三体和21-三体^［2］。低风险人群中，CPC胎儿发生非整倍体的风险约为1%^［3］。无创产前检测技术（non-invasive prenatal testing, NIPT）的出现为胎儿染色体非整倍体、染色体微缺失/重复综合征以及单基因遗传病的检测提供了可选方案^［4］，减轻了产前诊断的压力。目前，相关研究报道了NIPT应用于临床孕妇因血清学异常、高龄妊娠、超声异常等筛查胎儿染色体异常的检出率、阳性预测值（positive predictive value, PPV）等^［5］，但未见NIPT应用于孕妇因胎儿CPC筛查染色体异常的详细报道。因此，本研究将回顾性分析孕妇因胎儿CPC进行NIPT的临床资料，总结NIPT应用于CPC的临床价值，为CPC的遗传咨询提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2020年1月至2022年5月来郑州大学第一附属医院因CPC或CPC合并其他超声异常行NIPT的608例孕妇。纳入标准：①超声提示胎儿CPC的孕妇；②超声提示CPC合并其他超声软指标异常的孕妇。排除标准：①CPC合并血清学筛查异常者；②接受细胞治疗者；③体重指数>40 kg/m²者；④肿瘤患者；⑤移植手术或1年内异体输血者。本研究经郑州大学第一附属医院医学伦理委员会批准通过（批准号：2018-YB-08），研究对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 NIPT检测

采集孕妇外周血10 mL，提取血浆游离DNA，使用10 ng血浆游离DNA构建文库和定量。文库定量后，应用NextSeq 500基因测序仪（美国Illumina公司）进行高通量测序，生成约20 Mb reads（37 bp+8 bp index），修订后生成36 bp的基因组reads。染色体非整倍体采用Z值评分：首先使用比对到目标染色体上的唯一测序片段与所有染色体测序片段的比值计算目标染色体占全基因组的百分比（$\mathrm{\%}ChrN$），然后计算Z值，

$$Z=\frac{(\mathrm{\%}Chr{N}_{sample}-mean\mathrm{\%}Chr{N}_{reference})}{S.D.\mathrm{\%}Chr{N}_{reference}}$$

其中$mean\mathrm{\%}Chr{N}_{reference}$为对照正常目标染色体占全基因组百分比的平均值，$S.D.\mathrm{\%}Chr{N}_{reference}$为对照正常目标染色体占全基因组百分比的标准差。Z值-3~3为正常，Z>3或Z<-3提示为高风险。拷贝数变异（copy number variation, CNV）分析：使用RUPA算法将原始reads（15~30 Mb）比对至hg19参考基因组，然后分析唯一reads（10~19 Mb）。将reads分配至连续非重叠100 kb bins，并进一步过滤以剔除GC含量异常（<30%或>70%）和覆盖率较低的bins。利用主成分分析方法解决不同区段以及不同样本之间波动产生的“信噪比”，应用隐马尔可夫模型分析CNV，提高CNV的准确性。

1.2.2 CNV-seq检测

腹部碘酒消毒后，超声辅助引导下，孕11~13⁺⁶周行绒毛膜穿刺绒毛或18~24⁺⁶周行羊膜腔穿刺抽取羊水。提取绒毛或羊水样本DNA 1.0~1.5 μg；DNA打断、扩增，构建基因组文库；应用NextSeq 500基因测序仪（美国Illumina公司）进行染色体高通量测序。单端测序，读长为37 bp+8 bp，平均深度为0.1×，检测CNV分辨率为100 kb以上。测序数据通过OMIM、DECIPHER、DGV、ClinGen等数据库进行变异综合分析，判定染色体CNV的致病性。染色体核型分析：羊水细胞1 600 g离心10 min，将沉淀物加入羊水培养基转移到羊水细胞培养瓶中，置37℃、体积分数5％ CO₂培养箱培养7 d，更换培养液后继续培养至9~10 d观察羊水细胞生长状态。生长良好的细胞加入秋水仙素，G显带，应用GSL-120全自动核型扫描分析系统（德国Leica）采集染色体中期分裂相，挑选长短适中、分散良好的核型计数20个，分析5个，嵌合体及异常核型加倍计数至100个。核型分析标准按照人类细胞基因组学国际命名体系（ISCN2020）进行描述与诊断。

1.3 观察指标

①统计因胎儿CPC进行NIPT筛查的孕妇年龄，检测孕周及妊娠结局。②以侵入性产前诊断结果为金标准，探讨NIPT应用于CPC高风险孕妇筛查的临床价值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20软件分析数据，计数资料以百分率（%）表示，采用${\chi }^{\mathrm{2}}$检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胎儿CPC高风险孕妇的临床指征

608例孕妇的平均年龄为29.3岁，平均孕周为（19.3±2.8）周，其中≥35岁孕妇44例，平均年龄36.4岁，平均孕周（17.9±2.8）周，<35岁564例，平均年龄28.8岁，平均孕周（19.4±2.8）周。根据CPC合并其他超声异常，530例为iCPC，平均年龄为29.3岁，平均孕周为（19.3±2.8）周；78例为cCPC，平均年龄为29.4岁，平均孕周为（20.0±3.2）周。cCPC合并其他常见超声异常是心室强光点（46例）、肾盂分离（8例）、NT增厚（6例）、肠管回声增强（5例）、侧脑室增宽（3例）、鼻骨发育不良（3例）等。根据CPC的位置，608例超声异常孕妇分为三类：双侧CPC有304例，平均年龄为29.1岁，平均孕周为（19.1±2.8）周；左侧CPC有121例，平均年龄为29.7岁，平均孕周为（19.3±2.8）周；右侧CPC有183例，平均年龄为29.4岁，平均孕周为（19.7±2.8）周。

2.2 胎儿CPC高风险孕妇的产前诊断结果

608例孕妇进行NIPT筛查，共有16例胎儿为高风险，检出率为2.6%（16/608），9例为染色体非整倍体，7例为染色体CNV。16例高风险孕妇中，15例孕妇选择了浸入性产前诊断，确诊8例，PPV为53.3%（8/15）。确诊病例中，2例为21-三体，2例为18-三体，1例为嵌合型21-三体（嵌合比例为12%），1例为47, XXY，2例为临床意义未明的CNV，倾向良性变异，见表1。

表1  NIPT提示高风险孕妇的临床指征、产前诊断结果和妊娠结局

编号	年龄/岁	孕周/周	试管婴儿	超声结果	无创结果	核型结果	CNV-seq结果	真/假阳性	妊娠结果
1	30	16+2	否	双侧CPC,室间隔缺损	Chr18+,Z=6.73	47,XN,+18	47,XN,+18	真	终止妊娠
2	41	12+6	否	左侧CPC,NT=3.2 mm	Chr21+,Z=9.04	47,XN,+21	47,XN,+21	真	终止妊娠
3	30	27+3	否	左侧CPC	10q11.22-q11.23缺失3.0 Mb	46,XN	10q11.2q11.23杂合缺失1.64Mb,临床意义未明,良性变异可能大	真	出生正常
4	29	18+6	否	双侧CPC	ChrX+(Y),Z=4.08	46,XN	46,XN	假	出生正常
5	30	16+5	否	左侧CPC	1p36.33-p36.32重复2.5 Mb,19p13.3缺失3.1 Mb	46,XN	46,XN	假	出生正常
6	28	18+0	否	右侧CPC	6q25.3-q26重复6.3 Mb	46,XN	46,XN	假	出生正常
7	31	16+5	否	双侧CPC	Chr18+,Z=7.16	47,XN,+18	47,XN,+18	真	终止妊娠
8	33	24+2	否	双侧CPC	Chr21+,Z=5.47	46,XN,inv(9)(p11q12)	T21嵌合体,嵌合比例为12%	真	终止妊娠
9	33	18+2	否	双侧CPC	4p16.3-p16.1重复7.4 Mb	46,XN	46,XN	假	出生正常
10	29	24+1	否	双侧CPC,双肾盂分离,心室强光点	3p26.3-p26.2重复2.6 Mb	46,XN	3p26.3重复1.16 Mb,临床意义未明,良性变异可能性大	真	出生正常
11	22	17+5	是	双侧CPC	ChrX-,Z=-3.16	46,XN	46,XN	假	出生正常
12	32	20+2	否	右侧CPC,左心室强光点	8q22.3-q23.2缺失7.2 Mb	46,XN	46,XN	假	出生正常
13	20	18+0	否	双侧CPC,NT=5.0 mm	6q27重复5.3 Mb	未做	未做	未知	出生正常
14	34	23+5	否	右侧CPC	ChrX+(Y),Z=3.32	46,XN	46,XN	假	出生正常
15	31	24+4	否	左侧CPC,鼻骨发育不良	Chr21+,Z=11.56	47,XN,+21	47,XN,+21	真	终止妊娠
16	30	19+4	否	双侧CPC	ChrX+(Y),Z=3.19	47,XXY	47,XXY	真	终止妊娠

注：  NT为颈后透明层；XN中的N为X或Y染色体。

564例<35岁的孕妇中，15例为NIPT高风险，检出率为2.7%，14例进行侵入性诊断，确诊7例，PPV为50.0%。44例≥35岁的孕妇中，1例为NIPT高风险，检出率为2.3%，确诊1例，PPV为100%。≥35岁和<35岁的胎儿CPC检出率差异无统计学意义（${\chi }^{\mathrm{2}}$=0.000，P=1.000），PPV的统计学差异不满足计算要求。530例iCPC孕妇中，10例为NIPT高风险，检出率为1.9%，确诊4例，PPV为40.0%。78例cCPC孕妇中，6例为NIPT高风险，检出率为7.7%，5例进行侵入性诊断，确诊4例，PPV为80.0%。iCPC和cCPC的检出率差异有统计学意义（${\chi }^{\mathrm{2}}$=8.988, P=0.003），而iCPC和cCPC的PPV差异无统计学意义（${\chi }^{\mathrm{2}}$=0.853, P=0.182）。

304例双侧CPC中，9例为高风险，检出率为3.0%（9/304）。根据年龄，≥35岁的孕妇中未检出；<35岁的孕妇中9例高风险，8例进行侵入性诊断，确诊5例，PPV为62.5%。根据合并其他超声异常，iCPC的孕妇中6例为高风险，全部进行浸入性诊断，确诊3例，PPV为50.0%（3/6）；cCPC的孕妇中3例为高风险，2例进行侵入性诊断，确诊2例，PPV为100%，双侧CPC孕妇在整体PPV为62.5%（5/8）。

121例左侧CPC中，4例为高风险，检出率为3.3%（4/121）。根据年龄，≥35岁的孕妇中1例为高风险，且进行侵入性诊断，确诊1例，PPV为100%；<35岁的孕妇中3例高风险，全部进行侵入性诊断，确诊2例，PPV为66.7%（2/3）。根据合并其他超声异常，iCPC的孕妇中2例为高风险，全部进行浸入性诊断，确诊1例，PPV为50.0%（1/2）；cCPC的孕妇中2例为高风险，全部进行侵入性诊断，确诊2例，PPV为100%，左侧CPC孕妇在整体PPV为75.0%（3/4）。

183例右侧CPC中，3例为高风险，检出率为1.6%（3/183）。根据年龄，≥35岁的孕妇中未检出；<35岁的孕妇中3例高风险，3例进行侵入性诊断，确诊0例，PPV为0。根据合并其他超声异常，iCPC的孕妇中2例为高风险，全部进行浸入性诊断，确诊0例，PPV为0；cCPC的孕妇中1例为高风险，1例进行侵入性诊断，确诊0例，PPV为0。右侧CPC孕妇在整体PPV为0。通过比较双侧CPC、左侧CPC和右侧CPC的检出率差异无统计学意义（${\chi }^{\mathrm{2}}$=3.965, P=0.160）。

2.3 胎儿CPC高风险孕妇的妊娠结局和随访结果

16例NIPT高风险孕妇中，15例进行了产前诊断，确诊8例，其中3例为21-三体综合征（含1例嵌合体），2例为18-三体综合征，1例为47, XXY，孕妇均选择终止妊娠；2例为临床意义不明确的CNV（variants of unknown significance, VOUS），可能为良性变异，孕妇选择继续妊娠，胎儿出生指标正常。7例为假阳性，孕妇继续妊娠并监测胎儿的发育情况，胎儿出生指标正常。1例未行侵入性诊断，孕妇定期超声检测胎儿的发情况，胎儿脉络丛囊肿大约在孕28周左右消失，胎儿出生后指标正常，后期是否出现表型还需要长时间随访。592例NIPT低风险孕妇中，561例孕妇选择继续妊娠，并定期超声监测胎儿CPC及其他超声指标，胎儿CPC大约于孕32周前消失，截止随访时间，已出生胎儿未见明显异常；12例胎儿因孕中晚期出现其他超声异常如心脏存在缺陷、骨骼系统异常等引产；19例因失访未获得孕晚期检查结果和胎儿出生情况。

3 讨论

孕妇妊娠第6周后，由血管增生形成原始的脉络丛。在妊娠10~12周时脉络丛几乎占据整个侧脑室，12周后随孕周增长其迅速缩小。CPC是在脉络丛局部血管部分扩张包裹脑脊液，是一项重要的超声软指标，主要表现为侧脑室内边界清晰的无回声区，多以单侧单个囊肿出现，也可以双侧或单侧多个囊肿形式出现。由于CPC并不是由上皮细胞组织构成的，因此一般认为CPC为假性囊肿，大多在孕24~26周前消失。关于胎儿CPC与染色体异常存在不同的说法，如胎儿iCPC多无明确的病理意义；CPC胎儿的染色体异常率为1%~2%，最主要的染色体异常为18-三体、21-三体^［6］。本研究中，笔者对因胎儿CPC选择NIPT的608例孕妇的临床资料和产诊结果进行了回顾性分析，结果显示608例胎儿CPC中，NIPT提示16例胎儿为高风险，检出率为2.6%（16/608），确诊8例，含3例21-三体（含1例嵌合体），2例18-三体，1例47，XXY，2例VOUS，总异常率为1.3%（8/608），与相关研究结果一致^［7］，且提示CPC不仅与18-三体和21-三体相关，也与其他染色体异常相关，说明CPC与胎儿染色体异常存在相关性，但本研究样本量相对较小，需进行大样本量研究。

研究显示，CPC合并其他超声异常时患染色体异常的可能性增加^［8］。笔者通过比较iCPC和cCPC的检出率和PPV，发现NIPT应用于二者在胎儿染色体异常的检出率存在统计学差异，可能由于样本量的原因，NIPT在二者的PPV不存在统计学差异，但iCPC有10例NIPT高风险胎儿确诊4例，cCPC有6例NIPT高风险胎儿确诊4例，说明cCPC检出高风险胎儿确诊为染色体异常的概率大于iCPC，与相关研究结果一致。此外，双侧、左侧和右侧胎儿CPC检出率差异无统计学意义（${\chi }^{\mathrm{2}}$=3.965, P>0.05），可见CPC位置与染色体异常不存在相关性，但因样本量相对较小，该结论需要进一步验证。

脉络丛囊肿合并结构畸形是胎儿染色体异常的信号^［9］。研究表明cCPC染色体异常比例为11.02%，当CPC合并超声结构异常时染色体异常比例可增至33.33%^［10］。本研究是回顾性分析NIPT应用于CPC的临床价值，CPC合并超声结构异常应用侵入性产前诊断排除，而不是筛查技术，因此本研究尚未阐述CPC合并超声结构异常的结果。

IRANI等^［11］认为iCPC且孕妇血清学筛查阴性临床意义不大，张燕妮等^［12］认为iCPC一般不建议行染色体核型检查，因此CPC胎儿是否行侵入性产前诊断确定染色体异常存在争议。宋丽娜等^［13］报道核型分析和染色体微阵列分析（chromosomal microarray analysis, CMA）可应用于胎儿CPC的产前诊断，结果指出CMA检测CPC胎儿染色体异常更加敏感，是传统染色体G显带核型分析的补充。本研究回顾性分析了NIPT应用于608例超声提示CPC或CPC合并其他超声异常孕妇的临床资料和NIPT结果，说明NIPT可应用于超声提示胎儿CPC的筛查，且筛查结果的可靠性较高（PPV为53.3%）。超声提示CPC胎儿的孕妇担心胎儿可选择NIPT筛查，进而替代侵入性产前诊断，提高侵入性检查的检出率，降低阴性率，减轻产前诊断压力和孕妇的心理负担。

综上所述，CPC与胎儿染色体异常存在相关性，包括常见三体、性染色体非整倍体和染色体微缺失/微重复。NIPT可应用于超声提示胎儿CPC的可选筛查技术，且筛查结果的准确性较高，有助于提高侵入性产前诊断的检出率，降低产前诊断压力。