胎盘

摘要

目的

分析胎盘组织中ABCB4基因表达情况与妊娠期肝内胆汁淤积症（ICP）患者血液指标及妊娠结局的相关性。

方法

该回顾性研究病例纳入时间为2021年1月至2022年12月，研究对象为河南科技大学第二附属医院112例ICP患者，根据临床妊娠结局不同，将60例伴不良妊娠结局的ICP患者列为预后不良组，将52例正常分娩的ICP患者列为预后良好组。比较两组患者的胎盘ABCB4阳性表达率、ABCB4 mRNA相对表达量及血清胆汁酸、肝功能指标，经Spearman相关性系数验证胎盘ABCB4表达情况与ICP患者血液指标的相关性；通过绘制受试者工作特征（ROC）曲线验证胎盘ABCB4表达情况对不良妊娠结局的预测效能。

结果

经检测，预后不良组患者的ABCB4阳性表达率为85.00%（51/60），高于预后良好组73.08%（38/52），ABCB4 mRNA相对表达量为（7.75±2.31），低于预后良好组（9.03±2.49）（P<0.05）。预后不良组患者的胆汁酸水平为（55.25±10.31）mmol/L，谷草转氨酶（AST）水平为（88.39±10.47）U/L，谷丙转氨酶（ALT）水平为（85.11±10.61）U/L，均高于预后良好组［（48.24±10.47）mmol/L、（80.24±10.31）U/L、（78.45±10.17）U/L］（P<0.05）。经Spearman相关性系数检验，胎盘ABCB4阳性表达率会随胆汁酸、AST、ALT水平上升而不断升高，ABCB4 mRNA相对表达量会下降；经ROC曲线验证，ABCB4阳性表达率越高、ABCB4 mRNA相对表达量越低，ICP患者发生不良妊娠结局的风险越高。

结论

ICP患者的胎盘ABCB4阳性表达率会明显升高，ABCB4 mRNA相对表达量会明显下降，ABCB4阳性表达率与患者血液指标、不良妊娠结局发生率正相关，ABCB4 mRNA相对表达量与患者血液指标、不良妊娠结局发生率负相关。

关键词

胎盘ABCB4表达; 妊娠期肝内胆汁淤积症; 血液指标; 妊娠结局; 相关性分析

妊娠期肝内胆汁淤积症（ICP）为一种妊娠期常见并发症，此类患者临床多伴有皮肤瘙痒、黄疸等典型症状，经实验室检查可见其血清胆汁酸水平异常升高^［1］。目前临床尚未明确ICP的具体发病原因，但考虑与家族遗传、既往病史、孕期体内激素水平紊乱等因素密切相关，同时，若孕妇自身年龄≥35岁或伴人工受精等辅助生殖技术治疗史、慢性肝胆性疾病时，发病ICP的风险也相对较高^［2］。ICP患者的临床症状及体征一般可在分娩结束后自行恢复，但也有部分患者可因血清胆汁酸水平控制不佳而出现羊水污染、早产、围产儿窒息等多种不良妊娠结局，可对母体本身及新生儿生命安全造成严重威胁^［3-4］。目前针对此病临床尚未提出绝对理想的治疗方法，一般以对症治疗、缓解临床症状为主要治疗原则^［5］。近年国外有研究指出^［6］，转运编码基因ABCB4突变可参与ICP疾病的发生，且ABCB4蛋白高表达可增加新生儿不良预后发生风险。为进一步明确ICP发病机制并指导临床治疗，本研究旨在分析分析胎盘组织中ABCB4基因表达情况与ICP患者血液指标及妊娠结局的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本文为回顾性研究，病例纳入时间为2021年1月至2022年12月，研究对象为河南科技大学第二附属医院112例ICP患者，根据临床妊娠结局不同，将入组患者分为预后不良组（60例）和预后良好组（52例）。预后不良组中患者年龄23~35岁，平均（28.44±5.17）岁；孕周36~40周，平均（38.25±5.18）周；孕期体重指数（BMI）23.00~28.00 kg/m²，平均（25.58±5.13）kg/m²；产次：40例为初产妇，20例为经产妇。预后良好组中患者年龄24~34岁，平均（29.22±5.33）岁；孕周37~39周，平均（38.23±5.21）周；孕期BMI 23.50~27.00 kg/m²，平均（25.62±5.25）kg/m²；产次：35例为初产妇，17例为经产妇。两组患者一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本次研究已获得河南科技大学第二附属医院伦理委员批准（33929）。

纳入标准：①入组患者均符合ICP诊断要点^［7］；②均为单胎、足月妊娠；③年龄均≤35岁；④均知悉此次亚努就试验目的及内容，同意获取并公开既往临床资料。

排除标准：①伴妊娠期高血压、妊娠期糖尿病等^［8-9］合并症者；②伴有其他心肺、肝肾功能异常者；③恶性肿瘤者；④伴免疫功能障碍或其他感染性疾病者；⑤临床资料缺失者。

1.2 方法

胎盘ABCB4检测方法：①检测样本：于剖宫产术胎盘娩出后15 min内，在母体面中央区域剪取1 cm³大小胎盘组织，加入浓度为10%的甲醛溶液（上海溶剂厂，H31020858，规格：500 g）进行固定后备用。②ABCB4阳性表达率检测：经免疫组化法观察ABCB4的阳性表达率，对胎盘组织进行常规石蜡切片进行脱蜡处理，后加入0.01 mmol/L的柠檬酸钠缓冲溶液修复切片组织中抗原；加入浓度为3%的过氧化氢溶液（海德润制药，H11021382，规格：3%）后于室温下孵育10 min，并将内源性过氧化氢酶进行封闭；应用磷酸盐缓冲液对样本进行反复冲洗，后加入1∶10的ABCB4单抗稀释后孵育120 min；再次应用磷酸盐缓冲液（北京生物制品研究所，S10850002）反复冲洗并加入ABCB4单抗后再孵育30 min；经磷酸盐缓冲液进行第三次反复冲洗后加入二氨基联苯胺［北京沃凯生物科技有限公司，沪食药监械（准）字2013第1401615号］进行原位杂交显色反应并依次采用苏木素复染，经脱水、透明并应用中性树胶予以封片后，于显微镜下随机观察3个400倍视野，评估阳性细胞比例及染色强度。③ABCB4 mRNA相对表达量检测：经逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测ABCB4 mRNA的相对表达量，于冷冻的胎盘组织样本中加入生理盐水洗涤至无血色后，将其剪碎并置于匀浆器中；通过Trizol法提取ABCB4蛋白的RNA，于260 nm条件下测定并记录吸光度，以此计算ABCB4蛋白的RNA纯度及含量；取2 μg总RNA实施逆转录扩增，获取PCR产物后在95℃下予以5 min预变性，后予以3 s变性并在58℃下进行40 s退火，在72℃下进行30 s延伸，以此重复40次；测定ABCB4蛋白灰度，并参考β-actin灰度记录ABCB4 mRNA的相对表达量。

1.3 观察指标

①记录并对比两组患者的胎盘ABCB4阳性表达率、ABCB4 mRNA相对表达量；②检测并对比两组患者的血液指标，统一采集外周静脉血作抗凝处理，后按转速3 000 r/min，半径10 cm离心5 min后将血清样本送入AU5800全自动生化分析仪［美国，贝克曼库尔特公司，国食药监械（进）字2010第2402510号］中分别检测两组患者的胆汁酸水平、谷草转氨酶（AST）水平及谷丙转氨酶（ALT）水平，其中胆汁酸检测方法为酶联免疫吸附试验法，AST、ALT检测方法为放射免疫法。③经Spearman相关性系数检验ABCB4阳性表达率及mRNA相对表达量的相关性^［10］。④通过绘制受试者工作特征（ROC）曲线分析外泌体ABCB4阳性表达率及mRNA相对表达量与不良妊娠结局的相关性，当曲线下面积（AUC）>0.85时认为二者显著相关^［11］。

1.4 统计学方法

数据均采用软件SPSS 22.0处理，计数资料以百分率（%）表示，用${\chi }^{\mathrm{2}}$检验，计量资料以均数±标准差（$\overline{x}\pm s$）表示，用$t$检验；经Spearman相关性系数检验ABCB4阳性表达率及mRNA相对表达量的相关性；通过绘制受试者工作特征曲线（ROC）分析外泌体ABCB4阳性表达率及mRNA相对表达量与不良妊娠结局的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者的ABCB4表达情况比较

经检测，预后不良组的ABCB4阳性表达率高于预后良好组，ABCB4 mRNA相对表达量低于预后良好组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1  两组患者的ABCB4表达情况比较

组别	$n$	阳性表达率[$n$(%)]	mRNA相对表达量/($\overline{x}\pm s$)
预后不良组	60	51(85.00)	7.75±2.31
预后良好组	52	38(73.08)	9.03±2.49
t/${\chi }^2$		4.288	2.821
P		0.038	0.006

2.2 两组患者的血液指标比较

经检测，预后不良组患者的胆汁酸水平、AST、ALT均高于预后良好组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

表2  两组患者的血液指标比较 （$\overline{x}\pm s$）

组别	$n$	胆汁酸/(mmol/L)	AST/(U/L)	ALT/(U/L)
预后不良组	60	55.25±10.31	88.39±10.47	85.11±10.61
预后良好组	52	48.24±10.47	80.24±10.31	78.45±10.17
$t$		3.563	4.138	3.377
P		0.001	<0.001	0.001

2.3 ABCB4表达与血液指标的相关性

经Spearman相关性系数检验，胎盘ABCB4阳性表达率与ICP患者的胆汁酸、AST、ALT水平正相关，ABCB4 mRNA相对表达量与ICP患者的胆汁酸、AST、ALT水平负相关（P<0.05），见表3。

表3  ABCB4表达与血液指标的相关性

指标	ABCB4阳性表达率			ABCB4 mRNA相对表达量
	r	P		r	P
胆汁酸	0.255	0.006		-0.133	0.015
AST	0.249	0.009		-0.142	0.017
ALT	0.251	0.011		-0.139	0.020

2.4 ABCB4表达对不良妊娠结局的预测效能

经ROC曲线验证，ICP患者不良妊娠结局发生风险会随ABCB4阳性表达率升高、ABCB4 mRNA相对表达量降低而不断上升（AUC均>0.85），见表4、图1。

表4  ABCB4表达对不良妊娠结局的预测效能

指标	灵敏度/%	95%CI	特异度/%	95%CI	AUC	95%CI
(+)expn	78.25	85.50~70.32	79.44	86.20~71.43	0.854	0.785~0.887
mRNA	81.25	87.78~75.52	60.24	75.44~80.23	0.857	0.791~0.879

图1  ABCB4表达对不良妊娠结局预测ROC图

3 讨论

ICP为一种好发于妊娠中晚期的常见疾病，为一种可导致多种不良妊娠结局并严重威胁母婴生命安全的妊娠期并发症，目前认为，此病多见于自身合并非酒精性肝硬化、胰腺炎、胆囊炎、胆结石等多种慢性肝胆系统疾病患者，其发病考虑与孕期体内激素水平紊乱或个人遗传、环境因素等密切相关^［12］。因其发病机制复杂，现阶段临床仍缺乏治疗ICP的特殊方法，将胆汁酸水平下调至40 mmol/L及以下并缓解临床症状为ICP患者的主要治疗原则^［13］。近年随遗传基因和分子生物学研究的不断深入，人们逐步认识到可参与胆汁酸转运及分泌的多种基因载体在ICP发病机制中产生的重要作用，也有研究证实^［14］，ABCB4基因突变可导致DME3蛋白缺乏并抑制胆汁磷脂分泌或促使胆碱游离，随胆管细胞凋亡或坏死，孕妇胆道系统内可有大量胆汁预计并聚集为高浓度胆汁酸。

若胎盘组织中胆汁酸水平过高则会导致胎盘内血流因绒毛膜血管收缩不足而减少，进而影响胎盘的合成及转运^［15］。高水平胆汁酸不仅会增加羊水污染风险，还可直接损伤胎儿细胞及组织，导致胎儿宫内窘迫或新生儿窒息^［16］。研究表明^［17］，ABCB4为染色7q21.1的重要载体，为肝脏毛细胆管膜磷脂的主要输出泵，可有效保护胆管细胞免于胆汁盐损伤。本研究中，伴不良妊娠结局的预后不良组内患者的ABCB4阳性表达率高于预后良好组，ABCB4 mRNA相对表达量低于预后良好组，提示ABCB4表达情况与ICP患者预后情况有紧密联系。赵临潇等^［18］研究表明，ICP孕妇的ABCB4基因表达水平下降可增加不良妊娠结局发生风险，该研究中，ICP组内患者的阳性表达率明显高于对照组，ABCB4 mRNA相对表达量明显低于对照组，与本研究结果一致。国外相关研究指出^［19］，ABCB4与胆汁淤积有密切关联。ABCB4基因突变可导致DMR3蛋白匮乏、磷脂分泌减少，胆石症、AST活性增强所致肝胆疾病均可导致胆汁淤积，上述患者的ABCB4基因突变率为26.8%~44.4%不等。而本研究中，预后不良组患者的胆汁酸水平、AST、ALT均高于预后良好组，提示胆汁淤积程度越严重，ICP患者的胆汁酸水平及肝功能损伤程度更高。经Spearman相关性系数验证得知，胎盘ABCB4阳性表达率与ICP患者的胆汁酸、AST、ALT水平正相关，ABCB4 mRNA相对表达量与ICP患者的胆汁酸、AST、ALT水平负相关。且经ROC曲线验证后得知，ICP患者不良妊娠结局发生风险会随ABCB4阳性表达率升高、ABCB4 mRNA相对表达量降低而不断上升，提示通过检测ABCB4阳性表达率及mRNA相对表达量或可实现对ICP患者不良妊娠结局的有效预测。宇海燕等^［20］也表示，ABCB4表达水平越低，ICP患者不良妊娠结局的发生率越高，ABCB4表达或可成为预测患者妊娠结局的重要指标。与本研究结论具有一致性。

综上所述，ABCB4阳性表达率会随ICP胆汁酸水平、AST、ALT水平升高而上升，但ICP不良妊娠结局发生风险与ABCB4 mRNA相对表达量负相关。