摘要:目的应用DNA重组技术构建大鼠睫状神经节神经营养因子(CNTF)真核表达载体,再稳定转染肌源性干细胞,分析转染的肌源性干细胞能否稳定表达CNTF、并向神经元样细胞分化,为深入研究CNTF的功能及动物体内试验打下理论基础。方法用RT-PCR扩增大鼠带有Xho I和BamH I双酶切位点的CNTF cDNA片段,经双酶切获得的目的片段,再与双酶切过的pEGFP-C3质粒相连接,重组质粒转化E.coli DH5α感受态大肠杆菌,酶切方法鉴定阳性菌落。采用脂质体转染法,参照Lipofectamine2000试剂盒(LF2000I,nvitrogen公司)说明书,采用阳离子脂质体介导两组质粒(pEGFP-C3-CNTF和pEGFP-C3)转染成肌细胞。通过RT-PCR分析CNTF mRNA在成肌细胞中的表达,用神经元特异性蛋白(NES)免疫组化染色法鉴定是否有神经元样细胞分化,并于显微镜下计数阳性细胞占细胞总数的比例。结果通过PCR扩增成功获得了CNTF cDNA目的片段,大鼠CNTF真核表达载体构建成功,并成功转染成肌细胞,被转染的成肌细胞稳定表达CNTF并显著分化为神经元样细胞、实验组显著高于对照组(P<0.05),差异有统计学意义。结论大鼠CNTF真核表达载体pEGFP-C3-CNTF可以成功构建,并可转染大鼠成肌细胞,经转染的成肌细胞能有效表达大鼠的CNTF,且转染的成肌细胞显著分化为神经元样细胞,为研究大鼠CNTF在神经损伤修复方面的实验奠定了重要基础。
